R&D systems公司 ELISA 酶聯(lián)吸附免疫法Q&A

問：我的Quantikine試劑盒中的RD1測試稀釋劑看上去有沉淀物，可以用嗎？

答：有些RD1測試稀釋劑的確有不同程度的沉淀物。在這種情況下，我們在實驗步驟手冊中已做紀錄。

問：標準曲線為什么要采用4-pl擬合？

答：R&D Systems在研發(fā)和質(zhì)控我們絕大多數(shù)的Quantikine ELISA試劑盒時，采用4-相參數(shù)的曲線擬合（又名為4-pl或sigmoidal曲線擬合）。一般來說，它比log-log和直線有更好的曲線擬合。 如果數(shù)據(jù)分析不可用4-pl的話，log-log是下一個的選擇。

問：試驗步驟中說要用500 rpm，我的搖床達不到。這個速度是正確的嗎？

答：500 rpm使用的是0.12英寸的震蕩軌道。如果你的震蕩器用更大的震蕩軌道，500 rpm的確是過快了。在這種情況下，你應(yīng)根據(jù)R&D Systems的建議重新調(diào)整震蕩速度。你可拿一個多余的96孔微孔板，加入洗液，洗液的量與實驗時孔中的溶液量一致；封板后，調(diào)整震蕩器的速度，直到液 體在孔的上部劇烈旋轉(zhuǎn)但不濺到封膜上或產(chǎn)生泡沫為止。

問：我有太大變異系數(shù)（CV）的問題，是怎么回事？

答：zui大但不是*的兩個原因，可能是移液誤差和清洗方式。

問：Quantikine ELISA試劑為什么需要做稀釋？

答：主要有兩個原因：一，在絕大多數(shù)的樣本中細胞因子的含量非常高，如不經(jīng)稀釋，讀數(shù)將高于標準曲線；二，也是zui普遍的原因我們建議做稀釋，是將樣本中的干擾或基質(zhì)效應(yīng)稀釋掉。

問：我是否可以在任何時間過長步驟停止Quantikine試驗、延長溫育時間、或提高溫育的溫度？

答：R&D System不建議對任何Quantikine ELISA延長溫育時間。而且，當實驗步驟改變了，我們無法保證Quantikine ELISA的實驗結(jié)果。R&D System做“整個試劑盒的質(zhì)量控制"，就是說我們無法支持改變過的實驗步驟，因為它們未經(jīng)質(zhì)量控制。延長溫育時間、或提高溫育溫度以縮短溫育時間會提 高實驗的本底（又名空白或零標準）。這樣一來，樣本和標準中的低量細胞因子會測不到，因為增高了的本底信號將從所有孔中的數(shù)值中差減。

問：我用了DuoSet ELISA開發(fā)系統(tǒng)，但幾乎就沒有顏色產(chǎn)生。那些步驟可能出了問題？

答：很多方面都會影響到顏色的產(chǎn)生。比如：
1) BSA的干擾。選擇不含脂肪酸的ELIS*別的BSA很重要，可以降低球蛋白對實驗的干擾。R&D Systems建議使用Serological Proteins的BSA（目錄#82-045）。
2) 非室溫下的試劑在使用時會抑制信號；如果室溫過低，信號也會被抑制。
3) 如果使用了未表明為“高結(jié)合性ELISA"的微孔板，捕獲抗體同微孔板的結(jié)合就不牢固，從而導(dǎo)致測試的顏色產(chǎn)生過低。
4) 任何試劑，如果配制出錯、儲藏不當、或已過期，都將出現(xiàn)這一問題。
5) 讀板時使用的波長同低物的波長不一致。

問：我是否可以使用你們的抗體配對ELISA中的抗體，但用另一家公司的蛋白為標準？

答：若使用一家公司的抗體而用另一家公司的標準的帶來問題是它們會有不同的免疫活性（或不同的抗體與重組蛋白的結(jié)合力）。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)是因為 作為標準的重組蛋白同作為抗體免疫原的重組蛋白在蛋白序列或折疊中會有所不同，如果蛋白序列或折疊的不同發(fā)生在抗體結(jié)合部位，就會引起抗體對重組蛋白標準 的不識別或識別很差。