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瓊脂糖凝膠電泳點擊次數:2222 更新時間:2016-04-26

  瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DN段的常用方法。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應,DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷,在電場中向正極移動。由于糖磷酸骨架在結構上的重復性質,相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷,因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。不同濃度瓊脂糖凝膠可以分離從200bp至50kb的DN段。在瓊脂糖溶液中加入低濃度的溴化乙錠(ethidum bromide ,EB),在紫外光下可以檢出 10ng的DNA條帶,在電場中,pH8.0條件下,凝膠中帶負電荷的DNA向陽極遷移。

  瓊脂糖凝膠有如下特點:

  (1)DNA的分子大小 在凝膠基質中其遷移速率與堿基對數目的常用對數值成反比,分子越大遷移得越慢。

  (2)瓊脂糖濃度 一個特定大小的線形DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率(u)的對數與凝膠濃度(t)成線性關系。

  (3)電壓 低電壓時,線狀DN段遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加,不同分子量DN段的遷移率將以不同的幅度增長,隨著電壓的增加,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DN段的分辨率達到,所加電壓不得超過5v/cm。

  (4)電泳溫度 DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的電泳行為受電泳時的溫度影響不明顯,不同大小的DN段其相對遷移速率在4℃與30℃之間不發生明顯改變,但濃度低于0.5%的凝膠或低熔點凝膠較為脆弱,在4℃條件下電泳。

(5)嵌入染料 熒光染料溴化乙錠用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料嵌入到堆積的堿基對間并拉長線狀和帶缺口的環狀DNA,使其剛性更強,還會使線狀遷移率降低15%。

(6)離子強度 電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠,電導率zui小,DNA幾乎不移動,在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導很高并明顯產熱,嚴重時會引起凝膠熔化。

  對于天然的雙鏈,常用的幾種電泳緩沖液有TAE、TBE等,一般配制成濃縮母液,室溫保存,用時稀釋。

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